大家好，今天为大家介绍一篇发表在AdvancedMaterials上的文章，“ANanoformulation-MediatedMultifunctionalStemCellTherapywithImprovedBeta-AmyloidClearanceandNeuralRegenerationforAlzheimer’sDisease”。在这篇文章中，中科院苏州纳米技术与纳米仿生研究所王强斌教授课题组研究出一种用于治疗阿兹海默症的神经干细胞（neuralstemcell，NSC）纳米制剂PBAE-PLGA-Ag2S-RA-siSOX9（PPAR-siSOX9），除了具有较高的基因/药物递送能力，还可以通过量子点（quantumdot，QD）实时荧光成像，并在小鼠模型中成功验证其效用。经过基因工程的NSC可以持续稳定的表达脑啡肽酶（neprilysin，NEP），并增强小鼠大脑对β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）的降解和NSC的存活率。此外，单次使用该疗法可以对小鼠记忆障碍改善长达6个月，有进一步发展的潜力。
背景介绍
阿兹海默症（Alzheimer’sdisease,AD）目前是痴呆症最常见的病因，给社会带来了沉重的负担。它的主要病理是Aβ蛋白沉积、富含tau蛋白的神经元纤维缠结和神经炎，它们会逐渐导致大脑神经元和突触连接的丧失。然而现有的治疗方法由于无法再生患者脑内的丢失神经元，仅能预防或缓解阿兹海默症的症状，对于大脑严重损伤的患者则效果甚微。
近年来，基于干细胞的再生疗法用于阿兹海默症治疗展现出巨大的潜力，因为它可以通过生成功能性的神经细胞，并将其整合到现有的突触网络，从而再生受损的神经网络。而目前的干细胞疗法仍具有诸如无法清除Aβ与tau蛋白、从而导致NSC难以存活与分化、影响该疗法的长期有效性等局限性，因此需要开发出一种可兼顾Aβ清除和促进神经元再生与分化的治疗方案。
设计思路
作者设计了一种多功能的PBAE-PLGA-Ag2S-RA-siSOX9（PPAR-siSOX9）纳米制剂。PLGA和PBAE聚合物交叉覆盖在纳米制剂的表面上，以用作高效的药物和基因递送的载体。将表达siSOX9的质粒装入纳米制剂中，用于在细胞膜上表达可降解Aβ的蛋白酶NEP；此外，在质粒中插入mCherry基因用于表明纳米制剂对细胞的转染效率并筛选最佳的转染条件。视黄酸（retinoicacid，RA）则用于控制NSC的神经元分化。通过超声乳化法将疏水的Ag2SQDs封装在纳米制剂中，通过NIR-II成像追踪体内的NSCs。
图1.设计思路
实验部分
首先，作者用含有mCherry（荧光标记）和NEP基因的慢病毒转染原代神经干细胞，使NEP过表达，增强NSC对Aβ的降解能力。并使用AβELISA来衡量转染后的NEP-NSCs的Aβ降解能力。因为在细胞中表达的Aβ较少，作者引入了外源Aβ42和分泌Aβ42的细胞SH-SY5Y来检测NEP-NSCs和NEP-EVs对Aβ的降解效率，可以看出NEP-NSCs相对未转染的NSCs，降解Aβ能力显著提高；并且NEP的抑制剂thiorphan可以显著抑制二者对Aβ的降解（图2j）。对于NEP-EVs来说，也得到了类似的结果。并且，这也进一步导致NEP-NSCs的存活率相较NSCs有所上升（图2n）。
图2.NEP-NSCs和NEP-EVs对Aβ的降解能力
除了Aβ的清除，神经元再生也是阿兹海默症治疗的关键问题。因此作者设计了一种高效的基因和药物递送纳米制剂PPAR-siSOX9，以增强NEP-NSCs的神经元分化效率。
作者选用了可生物降解和生物相容的聚合物PBAE和PLGA作为纳米载体，并对PBAE与PLGA的比值、纳米制剂与质粒的比值、孵育时间、质粒浓度等反应条件进行优化，以获得高的基因转染效率。该纳米制剂可以有效的传递到细胞中，显著提高靶基因的表达，比市售转染试剂Lipofectamine有效四倍，并具有极好的生物相容性。
将纳米制剂成功递送到细胞之后，作者评估了其促进神经元分化的能力。在诱导分化后10天，对未经纳米制剂处理的细胞，大多数NEP-NSCs分化成星形胶质细胞（astrocytes）；而经过纳米制剂处理的细胞则分化产生了更多的神经元（图3）。
图3.PPAR-siSOX9处理前后的NEP-NSCs
为了更好地了解纳米制剂如何调节细胞信号通路以促进神经元分化，作者通过Westernblot分析了Wnt/β-catenin和RA信号通路中涉及的关键蛋白。纳米制剂对RA的控制释放促进Wnt2b表达，抑制GSK3β生成并促进β-catenin合成，从而激活Wnt/β-catenin信号通路并促进神经元分化。而且，质粒中siSOX9的表达显著降低了NEP-NSCs中SOX9的表达（图4e），从而减少了SOX9对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用，进一步促进了神经元的分化。此外，纳米制剂的处理不会干扰NEP的表达。
图4.Westernblot分析Wnt/β-catenin和RA信号通路中涉及的关键蛋白
图5.PPAR-siSOX9调节信号通路示意图
接下来，作者将纳米制剂NSC移植到APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的海马体中，并通过Ag2SQDs的NIR-II成像来示踪。用NEP-NSC治疗1个月和6个月后，小鼠脑中Aβ斑块的面积和大小均显著降低，表明NEP–NSC对AD小鼠有着长期的治疗作用（图6）。此外，免疫荧光的结果显示，NEP在海马细胞中与周围的微环境中均过表达；因此，随着NEP表达的改善，小鼠大脑神经元的活力和密度也得到了改善。
图6.治疗后1个月和6个月小鼠脑内的Aβ免疫荧光成像
最后，作者在对小鼠治疗1个月和6个月之后，对它们进行了莫里斯水迷宫实验（Morriswatermaze,MWM），以进一步评估该多功能疗法是否可以增强AD小鼠的记忆和认知功能。治疗1个月之后，小鼠在该训练中表现出显著的认知功能改善；相对于治疗后1个月的AD小鼠，治疗6个月后AD小鼠的认知功能略有下降，但仍具有很高的认知和记忆水平。通过同时改善小鼠AD模型中的Aβ清除率，细胞存活率和神经再生能力，首次实现了能够改善6个月以上的认知障碍的NSC治疗方案。
结语
综上所述，该课题组研究出一种综合纳米药物制剂，基因和干细胞的多重疗法，以实现有效且持久的Aβ降解和神经元再生功能。该体系在小鼠模型中成功验证，并可改变小鼠的认知障碍长达6个月。未来的研究重点将会在：1）将该策略转移到诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells,iPSC），可以使这种方法在临床实践中更容易实现；2）将该策略在遗传和药理学上与抗tau疗法相结合。
本文作者｜海猫
审稿｜果子狸，鲁班一号
责任编辑｜海猫
原文引用｜DOI:10./adma.
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
转载请注明：http://www.niaolgr.com/sjws/5879.html
当前位置： 视神经炎 > 视神经萎缩 > 文献分享AdvancedMateria
